? ? ? ?近期“生物世界”的一篇原創文章，介紹了Cell在今年2月15日發布的“Inhibitory CD161 receptor identified in glioma-infiltrating T cells by single-cell analysis”（圖1）。這篇論文的高光之處在于，單細胞在組織內成像的技術，實現了單細胞級別的蛋白表達檢測。并且，文中提出了類似于免疫治療的思路，將CD161視為潛在的治療靶點，阻斷CD161以激活細胞毒性T細胞（圖2）。 圖1 Cell最近發布的關于CD161的文章。高光之一：高技術，單細胞級別檢測CD161在T細胞的表達，這些T細胞滲透進入了神經膠質瘤組織。 圖2 高光之二：證明機制，具有細胞毒性的T細胞，也表達多種NK細胞受體。其中NK細胞表達的抑制型受體CD161，在T細胞也有表達，通過結合免疫調節細胞表達的CLEC2D，體現抑制活性。通過阻斷CD161與CLEC2D的結合，可以激活T細胞的活性。
一、給你一張過去的CD ? ? ? ?CD161，別名NKRP1A（NK受體P1A）、KLRB1、CLEC5D，以下均稱為CD161。其中，KLRB1（killer cell lectin-like receptor subfamily B1）是推薦的名稱，中文翻譯為“殺傷細胞的類凝集素受體亞家族B成員1號”。CD161目前只發現一種序列，沒有其他變體。 ? ? ? ?LLT1，別名CLEC2D（前言的Cell所稱），以下均稱為LLT1，作為CD161的配體。LLT1（lectin-like transcript 1）為CLEC2D的1號變體，中文翻譯“類凝集素轉錄體1”。這意味著CLEC2D存在多個變體，其中只有變體1，即LLT1，具有結合CD161的能力，且能夠激活下游信號。其他變體，比如變體2、4，不結合CD161。 ? ? ? ?CLEC，C-type lectin domain family，可見CD161和LLT1同屬于這個大家族，分屬不同的亞家族。 ? ? ? ?CD161和LLT1的表達 ? ? ? ?CD161主要表達于粒細胞，以及單個核細胞的表面（圖3A），表達特異性較好。單個核細胞，包括NK細胞和T細胞，其中T細胞包括Th17、NK T、記憶T細胞，但不包括原始T細胞（圖3B）。另外，IL-17的表達與CD161的表達有極大的相關性，比如CD4+ TCRαβ+、CD8+ TCRαβ+、CD4-CD8- TCRαβ+、CD4-CD8-TCRγδ+等產生IL-17的細胞，它們存在CD161表達。另外，CD161+的細胞，IL-23R和RORC的表達量顯著高于CD161-的細胞。 ? ? ? ?LLT1主要表達在小腸的派爾淋巴結，以及粒細胞、淋巴細胞（包括B細胞、T細胞、NK細胞）、扁桃體、肺、腎上腺、腎等部位（圖3C）。外周循環的B細胞、T細胞、NK細胞、單核細胞、樹突狀細胞，在靜息狀態下，不表達LLT1，但是激活后，比如TLR（toll-like receptor）激活的類漿細胞、單核細胞衍生的樹突狀細胞、激活的B細胞，都一定程度地表達LLT1，對NK細胞有抑制作用，但對T細胞具有激活作用。 圖3A，CD161在粒細胞和單個核細胞中高表達，主要在淋巴組織表達，摘自bgee.org。 圖3B，CD161的表達情況，分別在患者的上皮組織內淋巴細胞（灰）、肝淋巴細胞（白）、外周血淋巴細胞，分別是大約75%、60%、20%。其中，上皮組織內的CD3+CD161+陽性的天然T細胞，顯著高于CD3-CD161+的NK細胞。 圖3B，LLT1在小腸的派爾淋巴結高表達，主要在淋巴節和粒細胞表達，摘自bgee.org。 ? ? ? ?CD161和LLT1的信號通路 ? ? ? ?CD161在NK細胞上，作為抑制型受體，通過與其配體LLT1（CLEC2D）的結合，抑制NK細胞的細胞毒性，抑制IFN-γ的釋放（圖4A）。也有研究表明，在T細胞上，尤其是Th17上，CD161可作為其細胞亞群標記，為激活型受體，激活Th17表達和分泌IL-17（圖4B）。也可以通過TCR信號通路激活T細胞，促進IFN-γ的釋放。 圖4A，NK細胞機制。LLT1表達在特殊的腫瘤組織中，比如三陰性乳腺癌（TNBC）、前列腺癌、B細胞非霍奇金淋巴瘤細胞。表達于腫瘤細胞表面的LLT1，與NK細胞表達的CD161結合，給出抑制信號，降低其細胞毒性。LLT1在部分腫瘤組織中高表達，以抑制NK細胞的殺傷。 圖4B，T細胞機制。神經磷脂酶（ASM），調節CD39和CD161的細胞內信號，并促使Th17的增殖。在Th17分化條件下，CD4+ T細胞內，MHC/CD3/CD28，以及IL-6的刺激信號，激活mTOR和STAT3信號。同時，CD39和CD161的刺激信號進一步增強了上述信號，最終導致Th17增殖，以及分泌IL-17。 ? ? ? ?CD161的胞內區并沒有NK細胞受體常見結構域的ITIM，即“免疫受體中基于酪氨酸的抑制型模體”，或ITAM，激活性模體。因此，CD161激活后的下游信號，不同于常見的NK細胞受體激活模式，并且在NK、T細胞中可能產生了不同的結果：一方面，胞內域通過與CD39的結合，激活神經磷脂酶（ASM、SMPD1），通過STAT3、mTOR等通路，上調細胞內神經酰胺的表達；另一方面，激活AKT1/PKB和RPS6KA1/RSK1激酶和下游信號，這與通過CD3激活T細胞的通路一致。 ? ? ? ?研究表明，CD161的表達，受IL-12調控，依賴于IL-12作用時間和劑量。IL-12可提高NK細胞表面的CD161，進而抑制NK細胞活性，這是一個負反饋的過程。另一方面，IFN-β可導致CD161表達降低。? ? ? ? ?CD161和LLT1的結構和修飾 ? ? ? ?CD161是一種二型的穿膜糖蛋白，存在3對鏈內二硫鍵，以及1個N糖基化位點（圖5）。 ? ? ? ?LLT1也是一種二型的穿膜糖蛋白，存在2對鏈內二硫鍵，以及2個N糖基化位點（圖5）。 ? ? ? ?二型的穿膜蛋白，即N端為胞內域，C端為胞外域。 
 
圖5 CD161的結構信息，摘自Uniprot.org。CD161全長為225個氨基酸，保外域為67~225，其中含有3對鏈內二硫鍵，并存在1個N糖基化位點。 
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圖6 LLT1的結構信息，摘自Uniprot.org。LLT1全長為191個氨基酸，保外域為103~184，其中含有2對鏈內二硫鍵，并存在2個N糖基化位點。 ? ? ? ?考慮到如果我們篩選一種阻斷CD161-LLT1結合的抗體，N糖基化如果影響了表位的構象，那么抗體的結合也會受到N糖基化的影響。如果付諸于行動，這個修飾的問題是無法繞開的。
二、迷失自我的狂歡 ? ? ? ?從CD161在NK細胞上的調控模式看，存在順式作用（NK細胞能在某種刺激條件下，同時表達CD161和LLT1，抑制自身活性）、反式作用（B細胞、T細胞、樹突狀細胞表達LLT1，從而抑制NK細胞）。阻斷CD161-LLT1的結合，可以增強NK細胞的細胞毒性，釋放IFN-γ。 ? ? ? ?另一方面，CD161+CD8+的T細胞，被分類為組織追蹤MAIT（粘膜相關不變T細胞），細胞毒性Tc17細胞，或者記憶T細胞，具有組織追蹤和增強的細胞毒性。記憶細胞可以對病毒感染、細菌感染、抗原呈遞細胞的刺激做出響應，進而上調細胞因子，比如INF-γ、IL-17，釋放顆粒酶。 ? ? ? ?利用NK細胞的免疫檢查點機制，對NK細胞的抑制解除，以及激活，是一種新的免疫治療的前沿。我在之前的文章（https://mp.weixin.qq.com/s/5bWB41CAyKXi0348XTtIHw），總結了NK細胞作為免疫治療的新方向，列舉了一些NK細胞的激活或抑制型受體。比如激活型的KIR2DS、NKp80、NKp46/44/30、NKG2C/D/E、DNAM-1、CD16a，抑制型的KIR3DL、NKG2A/CD94、CD161/LLT1、PD-1、TIGIT、CD96、LAG3等（圖7、8）。 圖7 NK細胞表面的抑制型受體（紅）和激活型受體（綠）。ITIM，immuno-receptor tyrosine-based inhibitory motifs，免疫受體中基于酪氨酸的抑制型模體；ITAM，immuno-receptor tyrosine-based activation motifs，免疫受體中基于酪氨酸的激活型模體。KIR，killer Ig-like receptor，殺手細胞類免疫球蛋白受體。 圖8 NK細胞受體的分類。在NK細胞上，順式結合的CD161和LLT1，與MHC-I結合，抑制其活性。 ? ? ? ?NK細胞，占PBMC的5~10%，與CD8+ T細胞，有類似的殺傷活性（cytotoxicity），但是細胞的標記物與CD8+ T細胞有顯著差異，不表達CD3和TCR。NK細胞的抗原特征為CD56+CD3-，其中85%~95%的NK細胞為CD56dim（暗）CD16ahigh，主要是成熟的殺傷細胞，高表達KIR，可分泌穿孔素和顆粒酶，剩余的為CD56bright（亮）CD16alow，有未成熟的NK細胞，低表達KIR和NKG2A/CD94。NK細胞的分類中，還包括抗原呈遞NK（APNK）、輔助NK（NKh）、調節NK（NKreg）。 ? ? ? ?與T細胞需要抗原呈遞的過程不同，細胞毒性NK細胞是天然免疫系統的一部分，不需要抗原呈遞，組織相容性復合體（MHC）I類復合體與NK細胞結合，通常激活抑制型的受體（含ITIM，圖7），抑制了NK細胞的活性，這也是組織細胞避免被NK細胞殺傷的機制。在一部分腫瘤組織中，腫瘤細胞雖然下調了MHC-I的表達，規避了T細胞的識別，但因為MHC下調激活了NK細胞的活性，補充了T細胞的不足。 ? ? ? ?NK細胞的殺傷機制，稱為“missing self”，即“迷失自我”。也有研究表明，MHC-I可激活NK細胞（圖8）。因此，NK細胞的殺傷活性，基于抑制和激活信號的平衡。 ? ? ? ?因此，如果不考慮腫瘤內環境的惡劣、腫瘤細胞對NK細胞的塑造、調節型細胞的抑制的話，類比NKG2A/CD94，我們也可以將CD161/LLT1加入到這一場NK細胞“迷失自我的狂歡”中。目前，關于NK細胞的抗體（BiKE、TriKE），或者CAR-NK的臨床實驗，也在如火如荼進行中，也可以給我們一些借鑒。 ? ? ? ?然而，我們不能過于樂觀地估計NK細胞的殺傷，除了血液淋巴瘤，還有腫瘤微環境的巨大挑戰： ? ? ? ?1. 抑制信號，包括抑制型受體介導的（圖7、8），以及抑制型細胞因子，比如TGFβ、IL-10； ? ? ? ?2. 抑制細胞，Treg、NKreg、骨髓瘤衍生抑制型細胞（MDSC）、基質細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞；比如，Treg細胞、MDSC細胞表達TGFβ，結合NK細胞的TGFR2，從而下調其表面的NKG2D、NKp30這些激活型受體，使其被激活的能力降低； ? ? ? ?3. 浸潤能力，在非小細胞肺癌（NSCLC）中，未檢測到NK細胞亞群，但是存在CD161+CD4+、CD161+CD8+的T細胞。在結直腸癌中，幾乎完全排除NK細胞的浸潤； ? ? ? ?4. 腫瘤微環境中，缺氧、低糖，顆粒酶B的半衰期顯著降低。 ? ? ? ?我們可以通過IL-12、IL-15、IL-18，是NK細胞聚集在腫瘤組織并維持活性。然而，IL-12促進CD161的表達，進而抑制NK細胞的活性。IL-15具有促進NK細胞增殖和殺傷活性的能力，但是單獨使用，并不能維持NK細胞的滲透能力。
三、小結 ? ? ? ?本期推送，我們給大家介紹了CD161和LLT1，并且講述了CD161在NK細胞上的調控模式以及腫瘤微環境的巨大挑戰。下一期中，我們會接著帶來CD161成藥性的挑戰以及CD161在T細胞尤其是CD8+的T細胞的病理機制。 |
